LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Gníomhaíocht Bhitheolaíoch

In Vitro

Mar thoradh ar thraschur de chineál fiáin agus G2019S tá comhartha TR-FRET 2.5 huaire níos airde ar féidir cosc ​​a chur airLRRK2-IN-1ar bhealach a bhraitheann ar dháileog le luachanna IC50 de 0.08 µM agus 0.03 µM, faoi seach [1]. Bhí IC50 de 45 nM ag LRRK2-IN-1 chun DCLK2 a thoirmeasc agus taispeántar IC50 de níos mó ná 1 µM nuair a dhéantar meastóireacht air i dtástálacha bithcheimiceacha le haghaidh AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1, agus PLK1. Deimhnítear go gcuireann LRRK2-IN-1 cosc ​​ar MAPK7 le EC50 de 160 nM. Spreagann LRRK2-IN-1 cosc ​​ar spleáchas dáileog de phosphorylation Ser910 agus Ser935 in éineacht le cailliúint ceangailteach 14-3-3 le cineál fiáin LRRK2 agus LRRK2 [G2019S] a aistríodh ar bhealach cobhsaí i gcealla HEK293 [2]. Tá LRRK2-IN-1 measartha cíteatocsaineach le IC50 de 49.3 µM i gcealla HepG2. Taispeánann LRRK2-IN-1 géineatocsaineacht i láthair agus as láthair S9 ag 15.6 agus 3.9 µM, faoi seach [3]. Cuireann LRRK2-IN-1 cosc ​​ar iomadú, imirce, agus spreagann sé bás cille le sainmharcanna apoptóis de chealla HCT116 agus AsPC-1 [4].

I Vivo

Spreagann LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) díphosphorylation de LRRK2 in duáin na lucha [2]. Mar thoradh ar instealladh peritumoral de LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) tá laghdú suntasach ar mhéid meall agus meáchan xenagrafaíocht meall AsPC-1 [4].

Kinase Assay

Gníomhach GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) agus GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527 ) déantar einsím a íonú le sepharós glutathione ó lysate cille HEK293 36 h tar éis aistriú neamhbhuan na bhfoirgníochtaí cDNA cuí. Bunaítear measúnuithe kinase peiptíde, a dhéantar i ndúblach, i méid iomlán 40 µL ina bhfuil 0.5 µg LRRK2 kinase (a thugann íonacht thart ar 10% ag tiúchan deiridh 8 nM) i Tris / HCl 50 mM, pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 µM Nictide, 0.1 µM [γ-32P] ATP (500 cpm / pmol) agus na tiúchain léirithe den inhibitor tuaslagtha i DMSO. Tar éis goir ar feadh 15 nóiméad ag 30 ° C, cuirtear deireadh le frithghníomhartha trí 35 µL den mheascán imoibriúcháin a fheiceáil ar pháipéar fosphocellulose P81 agus a thumadh in aigéad fosfarach 50 mM. Nitear samplaí go fairsing agus déantar ionchorprú ATP [γ-32P] i Nictide a chainníochtú trí chomhaireamh Cerenkov. Ríomhtar luachanna IC50 le GraphPad Prism ag úsáid anailíse aischéimnithí neamhlíneach.

Measúnacht Cill

Cuirtear cealla (104 ceall in aghaidh an tobair) i bpláta cultúir fíocháin 96 tobair i dtrí uimhir. Saothraítear na cealla i láthair LRRK2-IN-1 le DMSO mar fheithicil ag 0, 0.31, 0.63, 1, 2, agus 5, 10, agus 20 μM. Cuirtear 48 h iarchóireáil, 10 μL d’imoibrí TACS MTT le gach tobar agus cothaítear na cealla ag 37 ° C go dtí go mbíonn deascán criostalach dorcha le feiceáil sna cealla. Ansin cuirtear 100 μL de 266 mM NH4OH i DMSO leis na toibreacha agus cuirtear ar chroiteoir pláta é ar luas íseal ar feadh 1 nóiméad. Tar éis dó a chroitheadh, ligtear don phláta goir ar feadh 10 nóiméad atá cosanta ó sholas agus léitear an OD550 do gach tobar ag úsáid léitheoir micreaphlaistigh. Déantar na torthaí a mheánú agus a ríomh mar chéatadán de rialú DMSO (feithicil) + / - earráid chaighdeánach an mheáin.

Riarachán Ainmhithe

LRRK2-IN-1a thuaslagadh i Captisol agus a riaradh trí instealladh intraperitoneal i lucha fireann fiáine C57BL / 6 ag dáileog de 100 mg / kg. Déantar lucha rialaithe a instealladh le toirt chomhionann de Captisol. Ag pointí ama 1 agus 2 h, déantar lucha a mhúchadh trí dislocation cheirbheacsach agus déantar fíochán duáin agus inchinne a dhíscaoileadh go tapa agus a snap-reoite i nítrigin leachtach.

Tagairtí

[1]. Hermanson SB, et al. Scagadh le haghaidh Coscóirí Úrscéal LRRK2 ag Úsáid Measúnacht Cheallach TR-FRET Ard-tréchur do LRRK2 Ser935 Phosphorylation.PLoS One. 2012; 7 (8): e43580. Epub 2012 Lúnasa 28.

[2]. Deng, Xianming., Et al. Tréithriú inhibitor roghnach den ghalar Parkinson' s kinase kinase LRRK2. Bitheolaíocht Cheimiceach an Dúlra (2011), 7 (4), 203-205.

[3]. Koshibu K, et al. Malartach ar LRRK2-IN-1 do Staidéar Cógaseolaíochta ar Ghalar Parkinson' s. Cógaseolaíocht. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. Weygant N, et al. Taispeánann inhibitor kinase móilín beag LRRK2-IN-1 gníomhaíocht láidir i gcoinne ailse cholaireicteach agus pancreatach trí chosc a chur ar kinase cosúil le doublecortin 1. Ailse Mol. 2014 Bealtaine 6; 13: 103